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真菌毒素的分析

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《粮食与饲料工业杂志》2016年第6期

摘要:

真菌毒素是某些真菌在生长过程中产生的有毒次级代谢产物,它们的种类繁多,玉米在生长及贮藏过程中经常会受到它们的感染;一定条件下,它们会和糖类或其他基质结合形成结合态形式,被称为隐蔽型真菌毒素,隐蔽型真菌毒素是当前研究的热点。阐述了玉米中常见的真菌毒素,例如:呕吐毒素、黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏马菌素、T-2和HT-2等的毒理学性质和检测方法,着重介绍了其隐蔽型毒素的形成、结构、毒理学性质和检测方法,旨在为今后的研究提供参考。

关键词:

玉米;真菌毒素;隐蔽型真菌毒素;毒理学性质;检测方法

真菌毒素一词来源于希腊语,是希腊语中的(真菌)和(毒物)的结合[1],目前已知的真菌毒素有300多种,主要影响玉米质量betway必威体育注册的菌种有呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、伏马菌素、T-2毒素和HT-2毒素以及它们的隐蔽型真菌毒素。真菌产生真菌毒素是自身的一种防御机制和/或有助于在宿主体内定植,所以真菌毒素是有毒的二级代谢产物。由于玉米的质量betway必威体育注册直接影响人畜的健康,这几种真菌毒素特别是其隐蔽型毒素的形成、结构、毒理学性质和检测方法成为国内外的研究者们探究的热点问题。概述了玉米中这几种常见的真菌毒素种类、性质和国内外主要的研究方法,介绍了其隐蔽型真菌毒素的形成、结构、毒理学性质和检测方法,旨在为今后的研究提供参考。

1玉米被真菌毒素污染的情况

我国是饲料生产第一大国,养殖业发展的兴衰与饲料质量betway必威体育注册息息相关,玉米被人们公认为“饲料之王”。玉米含有多种人体所必需的氨基酸[2]、黄体素、玉米黄质[3]以及谷固醇、卵磷脂、维生素等[4],有美容、明目和预防高血压和冠心病等功效。随着人们生活水平的提高和畜牧业的发展,玉米起着十分重要的作用。但是玉米的betway必威体育注册涉及各种微生物次级代谢产生的毒素,直接关系到人类健康。据FAO,约有25%的粮食产品受到真菌毒素的污染[5],平均有2%的粮食因为霉变而不能食用,至于真菌毒素对人畜产生的危害还无法估计。马皎洁等[6]于2010年在安徽、云南、福建、甘肃、广西、海南、黑龙江、湖北、湖南、江西、山西和上海等12个省(市/自治区)采集玉米及其制品、小麦粉、大米和花生共计650份样品,进行真菌毒素的检测,结果表明,215份玉米样品中有84.65%检出脱氧雪腐镰刀菌烯醇,其中7份样品中的DON污染水平超过我国规定的1000μg/kg限量标准,超标1.08~2.51倍(平均1.77倍);69.30%的玉米样品玉米赤霉烯酮呈阳性,其中23份样品中的ZEN水平超过我国规定的60μg/kg限量标准,超标1.06~19.19倍,平均4.32倍;53.02%的玉米样品还受到黄曲霉毒素的污染,其中有12份样品中的黄曲霉毒素B1(AFB1)含量超过了我国规定的20μg/kg限量标准,尤以云南、广西等地样品受污染较重。

2真菌毒素及其隐蔽型的种类及性质

玉米在生长、贮藏过程中,经常会受到黄曲霉毒素、伏马菌素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2和HT-2等毒素的污染。

2.1黄曲霉毒素黄曲霉毒素是由黄曲霉、寄生曲霉等产生的次生代谢物[7],主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等。其中AFB1在玉米、花生、坚果、大米和植物油等食品中均有分布,而且玉米被认为是受AFB1污染较为严重的农作物。AFB1不仅分布最为广泛,也是对人类健康危害最大的毒素之一[8-9]。由于具有较高的致癌性,世界各国对食品中的AFB1限量做出了严格规定。欧盟在98/53/EC指令中规定,人类直接食用的花生中AFB1的限量是2μg/kg。我国对食品中黄曲霉毒素等重要毒素规定了最高限量标准[10-14],在各类食品中AFB1的限量为0.5~20μg/kg[10]。

2.2伏马菌素及其隐蔽型伏马菌素是一组水溶性的霉菌毒素,主要由串珠镰孢菌、轮状镰孢菌、多育镰孢菌和其他一些镰孢菌产生[15]。常见的种类有FB1、FB2、FB3。因为处于生长期、储存期的农作物会经常受到串珠镰刀菌的污染,它广泛存在于亚洲、美洲、欧洲等北温带地区的谷物中,尤其是玉米污染最为严重。伏马菌素对人畜有很强的毒副作用,例如:马的脑白质软化症、猪的肺水肿等,中国、非洲的食道癌的高发生率和它也有一定的关系[16]。当前的研究热点主要在伏马菌素的隐蔽型上:[17]。有研究表明,是伏马菌素和还原糖热反应的产物,它的反应过程类似于在非酶褐变的过程中氨基酸和还原糖的反应。而在热的水溶液中和还原糖反应的初始产物经过Amadori重排列形成β-氨基酮,β-氨基酮被氧化形成[18]。伏马菌素的毒素反应主要是由伏马菌素结构上的氨基酸组导致的[19],当氨基酸和还原糖偶联后,形成的伏马菌素衍生物会降低原伏马菌素的毒素程度[20];但是在消化过程中,氨基酸组可能又会被释放出来。所以研究伏马菌素的隐蔽型对人畜的betway必威体育注册是非常重要的。

2.3呕吐毒素及其隐蔽型呕吐毒素(vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇,缩写为DON,它主要由镰刀菌属产生,它的危害主要表现为导致人畜的饮食量下降、呕吐、生长缓慢、抵抗力下降等[21]。在中国和印度,曾发生过因为食用了含有大剂量呕吐毒素的加工食品,而引起肠胃疾病等病例[22]。Collins等[23]认为,当DON的摄入量为5mg/(kg·d)时,会导致骨骼的异常生长而致畸型。它的隐蔽形式主要有:Deoxynivalenol-3-glucoside(D3G)、Deoxynivalenol-3-glucoside(3-ADON)、15-acetyl-deoxynivalenol(15-ADON)、Ni-valenol(NIV)和Fusarenon-X(FUS-X)。Ma-sayo[24]和Berthiller[25]研究表明,D3G广泛存在于自然生长的谷物中和被镰刀菌素感染的植物中,DON通过由植物酶催化的糖基化转化为D3G,它的毒理学作用和DON一样,都会影响蛋白质的生物合成。Jecfa[26]在2011年强调,D3G在哺乳动物的消化过程中,可能被乳酸菌所水解。虽然现在还不知道D3G在消化过程中是否能够重新裂解为呕吐毒素,但是依然会认为它对人类和动物的betway必威体育注册有潜在的危害[27]。3-ADON、15-ADON、NIV和FUS-X是呕吐毒素的乙酰基衍生物,Eriksn认为3-ADON和15-ADON的毒理学作用比DON还要高,对人畜的健康影响更大。Nathan[28]认为,植物在降解DON毒性时,会通过3-O-乙酰转移酶把DON变成3-ADON,而这个过程植物不能自己控制。虽然DON和ADON在化学结构上非常相似,但是当前对其转化方式的研究还很薄弱,在研究食品加工过程时,呕吐毒素的隐蔽型毒素对人畜的危害程度是当前研究的热点问题。

2.4玉米赤霉烯酮及其隐蔽型玉米赤霉烯酮又称F2毒素,是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物。它主要污染玉米、麦类、谷物等,而且在世界各地各种粮谷与饲料中均有存在。玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用,可引起动物发生雌激素亢进症,导致动物不孕或流产,对家禽、猪、牛和羊的影响较大,给畜牧业带来很大的经济损失[29]。α-赤霉烯醇和β-赤霉烯醇是玉米赤霉烯酮的生物转化形式,它们是由ZEN分子上的葡萄糖醛酸转化为葡糖苷酸而形成的[30],也可以由镰刀菌自然生成。最近调查显示,它们能干扰多种酶参与类固醇的代谢[31],有研究表明,在受污染的谷物中,它们比ZEN的存在率更高。α-赤霉烯醇的雌性激素的活性比ZEN还要高的,因此,研究α-赤霉烯醇和β-赤霉烯醇对农业经济及人畜的健康影响是非常重要的[32]。除了α-赤霉烯醇和β-赤霉烯醇,ZEN还会和葡萄糖苷形成ZEN-14-β,D-glucoside结合态,而且在拟南芥中,α-赤霉烯醇和β-赤霉烯醇也能和葡萄糖苷形成α,β-ZEL-14-β,D-glucosides。除了以上的ZEN结合态[33]。最近研究的热点还有ZEN-14-sulfate,它首先被Plasencia和Mirocha从接种禾谷镰刀菌的水稻中分离出来[32],虽然在酸性条件下部分硫酸盐键很容易被断开,但是这个结合态最能保持原ZEN的生物活性,因此,最近几年在检测游离或隐蔽的ZEN时,经常会检测ZEN-14-sulfate的含量[34-35]。目前,有很多学者对以上这些ZEN结合态做了大量的研究,但是对于它们检测方法的研究还非常欠缺。

2.5T-2和HT-2及其隐蔽型T-2毒素(T-2)是镰刀菌属霉菌在一定条件下产生的一组倍半萜烯类化合物,主要会危害动物的造血组织和免疫器官,引起动物的出血性综合征,会出现白细胞减少、贫血等症状,还会使胃肠道功能受损等[36-37]。3’-hydroxy-T-2和3’-hydroxy-HT-2toxins是T-2和HT-2毒素的氧化形式[38]。T-2毒素的异戊酰基的羟基化以及它的代谢是T-2毒素解毒的主要途径。在一些牲畜中,例如猪中CYP3As能够把T-2毒素转化成它的羟基化的形式,但是在鸡中CYP3As不能把把T-2毒素转化成它的羟基化的形式。对于这个方面,专家们经过进一步的调查研究得到P450能够把T-2toxin转化成3’-OH-T-2。关于它的解毒途径还需要进一步研究。

3国内外研究现状

国内外对真菌毒素的研究方法主要有酶联免疫吸附法、胶体金免疫吸附法、薄层色谱法、近红外光谱法、气相色谱法及气相色谱-质谱联用法、液相色谱及液相色谱-质谱联用法。

3.1黄曲霉毒素的检测国内外检测AFB1的方法有很多,例如薄层色谱法、半定量薄层色谱法、双向薄层色谱法、酶联免疫吸附法、免疫亲和荧光光度法、胶体金法。其中薄层色谱法是最常用的检测AFB1的方法,原理为AFB1经提取、浓缩、薄层分离后,在波长365nm下产生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来确定其含量[39]。国标中能同时检测AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法主要有免疫亲和柱净化-高效液相色谱法,它的原理为,试样采用甲醇溶液提取,过滤、稀释得滤液,滤液经含有黄曲霉毒素特异性抗体的免疫亲和层析柱层析净化,高效液相色谱仪分离,荧光检测器柱后光化学衍生来确定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量。该方法AFB1检出限为0.2μg/kg,AFB2检出限为0.2μg/kg,AFG1检出限为0.3μg/kg,AFG2检出限为0.3μg/kg;AFB1定量限为1.0μg/kg,AFB2定量限为1.0μg/kg,AFG1定量限为1.0μg/kg,AFG2定量限为1.0μg/kg[40]。

3.2伏马菌素的检测关于伏马菌素的检测国内外已建立了多种方法,例如薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、酶免疫法和胶体金免疫技术等。Preis等[41]在2000年应用免疫亲和柱净化、TLC/光密度法检测出了玉米中的FB1,该方法检出限为0.1mg/kg,平均回收率>85%,变异系数≤19%。根据AOAC995.15(FumonisinsB1、B2、B3incornLiquidchromatographicmethod),通过液相色谱法可以同时测定玉米中的FB1、FB2、FB3含量。原理为,经乙腈水溶液提取的提取液经固相萃取小柱净化,然后用乙酸-甲醇溶液将毒素洗涤出来,邻苯二醛被加入到洗涤溶液中,形成伏马菌素荧光衍生物,从而被液相色谱检测出来。2002年,Stephen采用LC-MS检测到了隐蔽型毒素N-(carboxym-ethyl)fumonisinB1和N-(1-deoxy-D-fructos-1-yl)fumonisinB1的存在[16]。

3.3玉米赤霉烯酮的检测玉米赤霉烯酮检测的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、免疫亲和柱-荧光检测法和酶联免疫法。国际上,玉米中的玉米赤霉烯酮主要是通过薄层色谱法检测的;而国标是通过免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定的。其原理为,先用提取液提取试样中的玉米赤霉烯酮,经免疫亲和柱净化,然后用高效液相色谱荧光检测器测定,外标法定量。该方法粮食和粮食制品的检出限为20μg/kg,酒类的检出限为20μg/kg,酱油、醋、酱及酱制品的检出限为50μg/kg[42]。对于它的隐蔽型毒素α-赤霉烯醇和β-赤霉烯醇,王瑞国等[43]采用液相色谱-串联质谱法进行了测定,结果表明,该方法α-赤霉烯醇回收率在78.3%~98.3%,β-赤霉烯醇的回收率在74.1%~94.8%。当前α,β-ZEL-14-β、D-glucosides和ZEN-14-sulfate的检测方法研究的比较少。

3.4呕吐毒素的检测国内外对于呕吐毒素的检测方法有很多,例如酶联免疫法、液相色谱法、薄层色谱法。国标关于谷物中的呕吐毒素(DON)的检测方法有薄层色谱法和免疫吸附法。薄层色谱法的原理为,谷物及其制品中的DON经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后,加热薄层板,由于在制备薄层板时加入了三氧化铝,使DON在365nm紫外灯下显蓝色荧光,然后与标准比较,该方法的检出限是0.1mg/kg[44]。至于它的隐蔽型毒素,国内外的学者研究的比较多,一般都是应用液质联用的办法检测它们。孙娟等[45]采用超高效液相色谱串联质谱法对3-ADON、15-ADON进行了检测,3-ADON和15-ADON的检出限都是1μg/kg,定量限为3μg/kg。

3.5T-2和HT-2毒素的检测国内外对于T-2毒素的检测方法主要有酶联免疫吸附分析技术、高效液相色谱法、薄层色谱法、液相色谱-串联质谱法和气相色谱及其联用技术。根据国标介绍,T-2毒素和HT-2毒素的测定是用薄层色谱法,原理为,配合饲料中的T-2毒素经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层板展开后,用质量分数20%的硫酸乙醇喷布,加热薄层板,使T-2毒素在365nm紫外光灯下显蓝色荧光,根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量来测定含量,此方法的检出限为1mg/kg[46]。2009年牟仁祥等[47]应用免疫亲和柱净化-液相色谱质谱法对粮谷中的T-2和HT-2毒素进行了测定,这两种毒素的平均回收率为76%~90%,T-2和HT-2毒素的检出限(S/N=3)分别为0.001、0.002mg/kg。

3.6多种毒素的同时检测因为玉米经常同时感染多种真菌毒素,所以应用一种检测方法检测单一的真菌毒素比较耗时。国内外经常应用HPLC-MS/MS同时检测谷物中的多种真菌毒素。在液质联用技术中,高效液相色谱与质谱优势互补,能将色谱分离效果好的优点与质谱灵敏度高、选择性好的优点结合起来,高灵敏度同步检测出玉米感染的多种真菌毒素。我国出口的花生、谷类及其制品中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马菌素B1、呕吐毒素、T-2和HT-2,可采用液相色谱串联质谱法同时检测[48]。

4总结与思考

玉米是饲料的核心原料,它的质量直接影响饲料的betway必威体育注册,饲料的betway必威体育注册性间接影响人畜的betway必威体育注册,但是玉米在生长过程中很容易受到真菌毒素的感染。研究玉米感染的真菌毒素对我国的食品betway必威体育注册具有重要的意义。至今为止国内外的学者们对真菌毒素的研究主要存在以下3个问题:

(1)对一些毒素的隐蔽态形式的检测方法的研究还很缺乏,例如N-(carboxymethyl)fumonisinB1、N-(1-deoxy-D-fructos-1-yl)fumonisinB1、α,β-ZEL-14-β、ZEN14S、NIV和FUS-X等,而且这些隐蔽毒素的标准品在国内外还很难买到,这导致对它们的检测有很大的困难。

(2)隐蔽型真菌毒素在人畜体内是否能够还原成原来的毒素,是否仍然还会对人畜的健康造成危害,还需要国内外的学者们继续深入研究。

(3)在同时检测多种真菌毒素时,应用液质联用技术虽然检测效率高、灵敏度强,但是由于不同真菌毒素的理化性质不同,提取净化时会使一些毒素流失,使同时检测多种真菌毒素的回收率没有单一检测时的高。针对以上的问题,建议采取以下措施:

(1)在深入了解隐蔽型真菌毒素的转化机制后,探索它们在液相色谱中的出峰时间,从而应用制备液相来进行制备,并进一步纯化得到隐蔽型真菌毒素的标准品。

(2)在探究隐蔽型真菌毒素在人畜体内是否还仍然对健康产生危害时,可以应用小鼠实验来进行探索。

(3)在同时提取净化多种真菌毒素时,不要单一使用一种提取液去进行多种真菌毒素的提取,而且亲和柱专一性很强的净化方式也不适合多种真菌毒素同时净化。虽然在对真菌毒素隐蔽型的研究及毒素同时检测方法的研究中还存在一些问题,但通过国内外的研究者们的不懈努力,相信这些问题很快就会被解决,开辟真菌毒素研究的新领域。

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[9]全国饲料工业标准化技术委员会.饲料卫生标准:GB13078—2001[S].北京:中国标准出版社,2001.

[10]全国饲料工业标准化技术委员会.饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量:GB13078.2—2006[S].北京:中国标准出版社,2006.

[11]全国饲料工业标准化技术委员会.配合饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的允许量:GB13078.3—2007[S].北京:中国标准出版社,2007.

[12]全国饲料工业标准化技术委员会.配合饲料中T-2毒素的允许量:GB21693-2008[S].北京:中国标准出版社,2008.

作者:王玉娇 张瑞英 兰静 张守文 单位:哈尔滨商业大学食品工程学院 黑龙江省农业科学院农产品质量betway必威体育注册研究所

粮食与饲料工业杂志责任编辑:杨雪    阅读:人次
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