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氟离子检验方法研究

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《药物生物技术杂志》2014年第二期

1分光光度法

分光光度法是通过测定有色物质在可见光范围内对光的吸收度,对该物质进行定量分析的方法,被测物在一定浓度范围内服从朗伯-比尔定律。氟离子在pH=4.1的乙酸盐缓冲介质中与氟试剂及硝酸镧反应生成蓝色三元络合物,其颜色强度与氟离子浓度成正比,在620nm波长处定量测定氟化物。该测定方法需分光光度计,显色剂等。目前已用于桑叶、牙膏和矿物质等材料或物品的氟含量测定,其稳定性好,简单而快速。此外本方法还可用于测定地面水、地下水和工业废水中的氟化物。该方法的影响因素包括:比色皿的光程、参比成分、pH值、检测顺序、显色时间等。当分光光度计使用光程30mm或10mm的比色皿时,最低检出浓度为含氟化物0.02mg/L,其测定上限浓度为0.08mg/L[14]。分光光度法中30mm比色皿改为10mm比色皿,氟试剂溶液及硝酸镧溶液的pH值配制要求改为5到7之间。以去离子水和试剂空白分别作为参比时,标样测定值均在给定的误差范围内,其均值分别为0.996mg/L和1.003mg/L[15]。在pH=4.6时,氟在0.02~0.28mg/L范围内呈直线关系[16]。研究还发现,样品在显色反应1h后基本上达到最大吸光度,故显色时间选择1h较0.5h好[17]。近年来,一些新型分光光度测定法被研发出来,如Barghouthi和Mereih提出用铝间苯二酚蓝复合物代替硝酸镧,分光光度测定范围为0.0~1.0mg/L[18],该方法简单,灵敏度高,可以被推荐为新的分光光度测定方法,从而用于检测饮用水中低浓度的氟。传统用于测定牙膏中氟和单氟磷酸钠的主要方法是离子色谱法,由于氟化物与常用的离子交换剂的结合很弱,可能导致定量不准确,在测量时需要两个校准曲线测定氟和单氟磷酸钠,过程较为繁琐。Themelis和Tzanavaras使用反向流动喷射分光光度法,使得氟测量浓度从0.0~9.0mg/L都表现为良好的线性关系,并且可以快速、简便、准确地测定牙膏中的氟离子和单氟磷酸钠[19]。

2离子选择电极法

离子选择电极是一种电化学传感器,在一定范围内,其电位与溶液中特定离子活性的对数呈线性关系,通过与已知离子浓度溶液的比较可求得未知溶液的离子活度。该法需离子计,如氟离子选择电极,甘汞电极。相比于其它检测氟离子的方法,如离子色谱法、分光光度法等,氟离子选择电极法的成本低,操作简单,是一种快速、高效的方法。该方法应用范围十分广泛,绝大多数测定样品中氟含量均采用了此方法。该法已用于蔬菜、水果、茶叶、蚕桑、药材、电镀废水、豆类、饲料、牙膏、人血、猪肉、碘盐、空气、香烟烟气、煤等物中氟含量的测定,也可用于测定地面水、地下水和工业废水中的氟化物,本方法的最低检测限为0.05mg/L,测定上限可达1900mg/L,适应pH值范围为5~8[20]。研究者通过该方法可测出桑叶中0.10μg/mL的氟离子[21]、牙膏中0.02μg/mL的氟离子[22]、以及尿液中0.10mg/L的氟离子[23]。离子选择电极的影响因素包括溶液的pH值、温度、搅拌、电极浸入深度与位置、测定顺序、电极平衡状态的调节等[24],其中,pH值的影响最为显著[25]。当溶液的pH值高于8,OH-离子就会显著影响测量结果;而当pH值低于5时,H+又会成为干扰因素。此外,测定溶液中其他离子也会对结果产生干扰,如Fe3+和Al3+等[26],需要采用纯度高的去离子水进行溶液的配制[27]。

3荧光指示剂

目前很多研究者期望发现新的氟特异的荧光探针来检测氟离子的浓度,氟荧光分析法由于其高敏感性、准确性以及多功能生物成像等特点受到了各方高度关注,各种各样的氟荧光探针被逐渐开发出来。基于这些探针产生的不同化学反应机制,我们将这些荧光剂分成3种:氢键类[氟和NH的H之间的氢键(酰胺,吡咯,吲哚,尿素和硫脲)],氟硼络合物类以及氟化物介导的脱甲硅烷基化类。

3.1氢键作为最小和电负性最强的原子,氟原子具有独特的化学性质,可以与其它原子、离子、原子团形成很强的氢键,大多数公开的氟荧光指示剂均基于氢键给体,如胺,尿素和咔唑等。近些年来,荧光阴离子探针由于其简单性,高度的特异性和检出下限低,而受到越来越多的关注。一般将荧光强度与氟离子浓度呈正比的探针称为荧光“打开”(turnon)探针,其性能相对更好,因为荧光“关闭”(turnoff)探针可能因其他粒子而产生假阳性现象,而且荧光“打开”探针更容易观察[28]。基于此原理的氟离子荧光剂有很多,例如,基于双水杨醛的氟离子荧光“打开”探针,在吸收和荧光光谱的变化时由OH-和氟化物的阴离子之间的氢键作用引起的,可能提供一种简单高效的双通道阴离子荧光探针[29]。此外,也有用于乙腈溶液而非水溶液的荧光“打开”指示剂,其也显示出很好的选择性[30]。

3.2硼氟络合物

除了依靠氟离子所产生的氢键而研制成的荧光剂外,氟离子能作为电子对的给予体,如氟离子和硼离子之间极强的亲和性,研制出新型的氟离子荧光剂。目前,可以用作氟离子探针领域的有机硼化合物分为两类,即三芳基硼化合物、硼酸和硼酸酯的有机硼化合物。

三芳基硼化合物很早就有人认为3价硼化合物可以作为有效的荧光剂检测氟化物,最终Yamaguchi等人[31]将该理论变为现实,他们首次把三芳基硼用于氟离子的比色法检测,通过滴定曲线计算得到的结合常数为(2.8±0.3)×105mol/L,该发现可以作为3价硼化合物氟荧光剂的一个里程碑,其存在的问题是结合系数过低,对于负离子不够敏感。为了解决这一问题,Wang等[32]制成了一种氟离子荧光硼剂,其原理是基于B-N衍生物的不同电荷转移发射,这种双齿化合物的结合常数为5×109mol/L。一种由三芳基硼化合物与卟啉共价结合形成的新化合物,实现了对氟离子的比色法检测[33]。同时,这类化合物作为荧光探针,可以表现出“关”和“开”的两种效应,提高了检测的方便性和灵敏性。这类新型的双光子氟离子探针具有8倍的放大效应,可作为高选择性和高灵敏度的双光子荧光氟离子探针[34]。尽管有机硼π-共轭化合物可以高选择性、高灵敏度识别氟离子,但由于氟离子与水具有很强的结合能力,因此有机硼化合物对氟离子的识别一般仅适用于有机相。为了增强三芳基硼烷在水溶液中对氟离子的结合能力,各种不同的双齿型硼烷氟离子荧光检测剂相继被报道,Gabbai等[35-36]合成的离子型硼烷可以实现在纯水中检测2×10-6~4×10-6数量级的氟离子。溶液pH值会影响氟离子的结合,在pH=4.9的溶液中,该化合物可与1.9×10-6的氟离子结合,其吸光度降低63%,而pH为6时,吸光度则降低50%[37]。

3.3氟化物介导的脱甲硅烷基化

目前,大部分氟离子荧光剂都是基于氢键键合和硼氟络合物原理,具有高选择性及高灵敏度,但在生物体内应用存在一定局限。由于氟离子具有强烈的水化倾向,因此氢键键合的方法不能有效在水介质中实现,同时硼氟络合物存在细胞毒性、自身不稳定性等的局限。近年新出现的氟化物介导脱甲硅基法可以很好地解决这些问题[38]。双光子显微成像技术相对于单光子显微成像技术有很多优点,如细胞损害小、成像灵敏度高、数据获取效率高和防止组织自发荧光等。DokyoungKim等[39]报道了一种香豆素类衍生物可作为一种新型的双光子吸收材料用于检测氟离子,该染料在斑马鱼体内可以作为一种性能良好的氟荧光指示剂,在pH=7.4的缓冲液[20%CH3CN的10mmol/LHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、20mmol/LNaF]中,相对于其它阴离子(Cl-、CN-、Br-、I-、NO3-、HSO4-、ClO4-、PF6-、CH3COO-、SCN-和N3-),该染料其对氟离子具有极高的选择性,其测量范围极广(0×10-6~1600×10-6),而且在pH4~10都可以发挥作用。虽然如此,香豆素类衍生物必须由紫外光激发,这就会对细胞产生一定的杀伤作用。

4结论及展望

目前,各种传统的氟离子测定方法较多,既有一定优势,也有不足,主要依赖指定的标准曲线来测定氟离子的浓度,但其影响因素较多,因而影响测量结果。氟离子荧光剂作为近来研制出的氟离子检测方法,与传统方法相比,它们具有高选择性及高灵敏度。其中,氟化物介导的脱甲硅烷基化特有的高敏感性、准确性以及多功能生物成像,对于氟离子检测分析提供了方便快捷的解决方案,同时实现了对生物体内氟离子浓度的检测,这就为科研工作以及临床检测提供可能。因此,氟离子荧光指示剂法在氟离子的检测方面将会得到越来越广泛的应用。相信在不久的将来氟离子荧光剂技术将会更多的造福于人类。

作者:焦阳段小红单位:第四军医大学口腔医院口腔生物学教研室

药物生物技术杂志责任编辑:田老师    阅读:人次

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