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枣园绿盲蝽越冬卵的寄生作用

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《中国生物防治学报》2016年第三期

摘要:

在华北地区枣园中,发现了绿盲蝽的一种卵寄生蜂,形态鉴定为盲蝽黑卵蜂Telenomussp.。直接观察寄生蜂羽化情况表明,绿盲蝽越冬卵中盲蝽黑卵蜂的寄生率为0.67%~1.25%。设计了盲蝽黑卵蜂的特异性引物,对绿盲蝽越冬卵的分子检测显示,寄生率为13.04%~23.91%。与直接观察方法相比,分子检测技术能更加准确地评估盲蝽黑卵蜂对绿盲蝽卵的寄生作用。

关键词:

绿盲蝽;盲蝽黑卵蜂;枣园;越冬卵;寄生作用

绿盲蝽Apolyguslucorum(Meyer-Dür)是当前我国棉花、枣、梨、葡萄等多种农作物生产中的一种重要害虫[1-3]。绿盲蝽成虫和若虫均能以口针刺吸为害寄主植物的幼嫩组织,导致叶片破损、落蕾落花、果实畸形等,对农作物产量和品质造成严重影响[4,5]。我国系统开展了绿盲蝽天敌资源的调查研究[6,7],其中优势若虫寄生蜂——红颈常室茧蜂PeristenusspretusChenetvanAchterberg已实现人工规模饲养与田间释放应用[8,9]。绿盲蝽的卵常产在植物组织中,仅留卵盖在植物表面,卵盖长不足1mm,颜色较浅,肉眼难于发现;同时,卵多为散产[4]。这一习性使得绿盲蝽卵难于收集与观察,限制了对其卵寄生蜂的研究。1958年,朱弘复和孟祥玲[10]记载了盲蝽的3种卵寄生蜂:点脉缨小蜂Anagrussp.、盲蝽黑卵蜂Telenomussp.和柄缨小蜂Polynemasp.,但由于绿盲蝽卵收集难而未对其田间寄生率进行详细调查。研究发现,秋季绿盲蝽末代成虫偏好在果树枝条修剪残茬等部位上产卵,越冬卵分布相对集中[5,11],这为绿盲蝽卵寄生蜂的种类调查等研究提供了可能。本文对华北地区枣园中绿盲蝽卵寄生蜂种类进行了调查,并利用直接观察和特异性引物检测2种方法评估了寄生蜂对绿盲蝽越冬卵的寄生情况。

1材料与方法

1.1室内观察2011、2013、2014和2015年的4月初,在绿盲蝽越冬卵孵化之前,从中国农业科学院廊坊科研中试基地(河北廊坊,39.53ºN,116.70ºE)周边的枣园中剪取枣树断枝。枣园面积约为3hm2,枣树品种为“金丝小枣”,树龄为5年,树高3m。在枣园随机剪取枣树断枝,带回室内在显微镜下,用昆虫针将断枝茬口的绿盲蝽越冬卵逐一挑出,将完好的卵放入底部铺有一层吸水纸的培养皿(直径为9cm)中,加入一个湿润棉球进行保湿,然后将培养皿盖好后放置于25℃、RH65%、光周期14L:10D的培养箱中,逐日观察与记录寄生蜂的羽化情况。将羽化后的寄生蜂保存在75%的乙醇中,用于形态鉴定。

1.2分子检测

1.2.1供试虫源绿盲蝽采自中国农业科学院廊坊科研中试基地棉田,用新鲜的四季豆PhaseolusvulgarisL.豆荚在室内进行继代饲养[12]。用于寄生蜂引物特异性检测的非靶标昆虫中黑盲蝽Adelphocorissuturalis(Jakovlev)、苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus(Goeze)、三点盲蝽Adelphocorisfasciaticollis(Reuter)和牧草盲蝽LyguspratensisL.同样为实验室种群。枣树ZiziphusjujubeMill.、葡萄树VitisviniferaL.枝条均采自中国农业科学院廊坊科研中试基地周边果园。供试昆虫取样前,先饥饿24h,以去除腹部残留食物。植物枝条用清水冲洗干净后,于20℃下保存备用。

1.2.2DNA提取提取昆虫基因组DNA前,将单头昆虫于清水浸泡12h,去除可能存留于体表的杂质。之后将虫体转入1.5mL离心管中,用研磨棒将其磨碎,按照TIANampGenomicDNAKit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书单头提取绿盲蝽及非靶标昆虫的DNA,试剂购自天根生物(北京)有限公司。将剪碎的1g植物组织放入研钵中,加入液氮用研磨棒磨碎,用DNAsecureplantkit新型植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生物(北京)有限公司,进行DNA提取。

1.2.3引物设计先用COI通用引物(LepF1:5′ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG3′和LepR1:5′TAAACTTCGGATGTCCAAAAAATCA3′)扩增绿盲蝽卵寄生蜂COI序列,测序后根据物种间不同碱基位点设计并获得寄生蜂的引物。PCR扩增总体系为20μL,包括0.4μLdNTPs(2.5mmol/L),2.0μLEasyTaqbuffer(10×),0.4μL正向引物(10μmol/L),0.4μL反向引物(10μmol/L),0.2μLEasyTaqDNA酶,15.6μLddH2O和1.0μLDNA模板。PCR扩增条件为:94℃预变性4min;94℃变性30s,45℃退火30s,72℃延伸30s,共5个循环;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共40个循环;72℃后延伸10min。

1.2.4引物特异性检测以常见盲蝽(绿盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽、牧草盲蝽)[13]和绿盲蝽的主要越冬寄主(枣树、葡萄树)[14]作为非目标物种模板,以待测的绿盲蝽卵寄生蜂作为阳性对照模板,清水作为阴性对照,应用上述所设计的引物对以上模板进行PCR扩增,检测该对引物的特异性。PCR扩增条件为:94℃预变性4min;94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸30s,共40个循环。

1.2.5引物灵敏度检测以绿盲蝽卵寄生蜂DNA提取液为母液,进行2倍梯度稀释,应用筛选到的特异性引物和1.2.4所述程序进行PCR扩增,直到稀释液模板未能检测到目的条带为止。

1.2.6卵寄生情况检测2014和2015年的4月初,分别于河北廊坊、山东沾化(37.69ºN,118.12ºE)的枣园中随机采集枣树枝条,在显微镜下观察并收集绿盲蝽越冬卵。沾化枣树品种为“冬枣”,树龄为6年,树高2m。提取单粒卵基因组DNA,应用上述特异性引物检测寄生蜂对绿盲蝽越冬卵的寄生情况。

2结果与分析

2.1室内饲养寄生率2011年以及2013—2015年,从河北廊坊的枣园中分别采集绿盲蝽越冬卵6000、9500、5800与400粒,其中寄生蜂寄生率依次为0.67%、1.14%、0.72%与1.25%,4年平均寄生率为0.90%(表1)。经形态鉴定,调查发现的寄生蜂为盲蝽黑卵蜂Telenomussp。

2.2分子检测寄生率

2.2.1引物特异性检测以绿盲蝽、中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽、牧草盲蝽以及枣树、葡萄树等非目标物种模板为对照,检测引物TeF1/TeR1的物种特异性。结果表明,该引物仅对盲蝽黑卵蜂具有扩增能力,扩增片段为225bp,片段单一且清晰,对非目标物种不具有扩增能力,证明该引物具有很强的特异性(图1)。

2.2.2引物灵敏度检测对特异性引物TeF1/TeR1做最低检出限检测,以梯度稀释后的盲蝽黑卵蜂DNA(初始浓度为9.80ng/μL)为模板进行PCR扩增。检测结果显示,该引物具有较高的灵敏度,最低检出限如泳道5所示为0.61ng/μL(图2)。

2.2.3寄生率检测对河北廊坊、山东沾化枣园中绿盲蝽越冬卵进行寄生率的检测,结果显示,盲蝽黑卵蜂对绿盲蝽越冬卵具有较强寄生能力。2014年,河北廊坊绿盲蝽越冬卵的寄生率为23.91%;2014年和2015年,山东沾化地区枣园绿盲蝽越冬卵寄生率分别为13.04%和20.73%(表2)。

3讨论

物种特异性引物检测技术是一种基于PCR的快速检测方法,近年来发展迅速,已成为害虫与天敌寄生关系研究及其寄生率评估的重要手段[15-18]。Agusti等[19]发展了汤普森厉寄蝇Lydellathompsoni(Herting)和稻苞虫赛寄蝇Pseudoperichaetanigrolineat(aWalker)的COI特异性引物,检测其对玉米上玉米螟Ostrinianubilali(sHübner)滞育幼虫的寄生情况,发现二者对玉米螟的寄生率均较低,分别为2.16%和2.83%。Traugott等[20]设计了半闭弯尾姬蜂DiadegmasemiclausumHellen、粉蝶盘绒茧蜂Cotesiaglomerata(L.)和微红盘绒茧蜂Cotesiarubecula(Marshall)的COI特异性引物及其多重PCR检测体系,对结球甘蓝有机种植园中3种害虫进行检测发现,半闭弯尾姬蜂对小菜蛾Plutellaxylostella(L.)的寄生率为33.4%;粉蝶盘绒茧蜂对欧洲粉蝶Pierisbrassicae(L.)、微红盘绒茧蜂对菜青虫Pierisrapae(L.)的寄生率分别为52%和53.4%。

本研究设计了盲蝽黑卵蜂的COI特异性引物,检测发现在枣园中对绿盲蝽越冬卵的寄生率在13.04%~23.91%,表明该寄生蜂对绿盲蝽卵具有较强的控制作用。发展的盲蝽黑卵蜂分子检测技术能有效克服盲蝽卵小、其寄生蜂研究难的问题,有助于后续开展不同季节绿盲蝽卵寄生率的系统调查。盲蝽黑卵蜂COI特异性引物对中黑盲蝽、苜蓿盲蝽、三点盲蝽、牧草盲蝽以及葡萄树同样不具扩增能力,具有特异性,为下一步评价盲蝽黑卵蜂对上述盲蝽种类的寄生作用、以及在葡萄园的控害功能奠定了基础。在昆虫寄生作用的评估中,分子检测结果与直接观察法所得结果常相差较大。如Ashfaq等[21]检测紫花苜蓿地中的淡足常室茧蜂Peristenuspallipes(Curtis)对盲蝽的寄生作用,其中90%以上为Lygusborealis(Kelton)所寄生,常规饲养法测得2001年和2002年的羽化率分别为29%和21%,远小于PCR检测的寄生率78%和64%。这主要因为羽化率评估中忽视了寄生蜂未成功发育羽化的情况,会低估寄生效率。同时,和直接观察法相比,PCR检测技术甚至可以检测到处于卵期的寄生蜂[22]。

本研究中盲蝽黑卵蜂饲养寄生率不足2%,远远低于PCR检测所得的寄生率。在1个多月的直接观察过程中,我们发现大量越冬卵因失水干瘪、被微生物寄生等原因而死亡,既不出蜂也不孵化,这是导致上述结果差异的主要原因。综合上述分析,PCR检测技术可以更加准确有效地评估寄生蜂的寄生能力,同时极大地缩短了寄生率检测时间。本研究首次探究寄生蜂对绿盲蝽卵的控制能力,为生产上这种天敌的挖掘利用提供科学依据,同时为优化绿盲蝽防治技术提供新思路。

作者:李金花 潘洪生 杨帆 罗淑萍 袁海滨 陆宴辉 单位:天津科技大学机械工程学院

中国生物防治学报责任编辑:杨雪    阅读:人次
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