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酵母在工业生物技术中的应用

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《中国生物工程杂志杂志》2014年第七期

1K.marxianus生产酶类

K.marxianus在产酶方面的应用是其在现代工业生物技术应用过程中的最重要的组成部分之一。实验结果表明,K.marxianus可以分泌产生十余种工业生物技术领域的水解酶(表1)。K.marxianus在生产酶类方面具有的优势,除去本身的耐高温、生长快等特点,还可以利用较为廉价的底物或者诱导物,如乳清和玉米浆[4]等发酵生产酶类,是工业生产过程中获得更为廉价、更多种类酶类的重要保证。同时,一些热稳定酶类如脂肪酶、葡萄糖苷酶等均可以从K.marxianus的培养过程中获得。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)或者乳糖酶可以水解奶制品中的乳糖供许多乳糖不耐症患者食用,可以解决乳清的处理问题,而且还能生成一种功能性食品 添加剂———低聚半乳糖,促进人体内双歧杆菌等益生菌增殖,在食品和医药工业中具有重要应用。目前的商业用半乳糖酶一般来自于乳酸克鲁维等菌株,但其分泌效率太低。K.marxianus是近年来备受关注的产酶菌株,其产生的半乳糖苷酶是一种诱导酶,在葡萄糖培养基中表达量不高,在含有乳糖的培养基中能够得到较高产量的半乳糖苷酶。但也有研究表明一些其他的廉价底物也可以作为诱导物用于K.marxianus半乳糖苷酶的生产,如玉米浆。以100g/L的玉米浆为底物,K.marxianus所产半乳糖苷酶比用乳糖为培养基时高20%。此外,溶氧对半乳糖苷酶的生产至关重要,当搅拌转速/通气速率为700r/min/0.66vvm时,半乳糖苷酶的产量比在500r/min/2vvm时高50%。采用γ-射线对K.marxianus进行诱变后,提高了β-半乳糖苷酶的产量及对热的耐受性,敲除转录抑制因子Mig1的突变株K.marxianusKM实现了β-半乳糖苷酶的过表达,达到121.0U/ml。同时,由于半乳糖苷酶是胞内酶,为了提高其水解乳糖的效果,纯酶的使用更能满足产业化需求。因此,研究半乳糖苷酶分离纯化方法,是满足其工业化使用的必要前提。

菊粉酶是一类能够水解β-2,1果糖糖苷键的水解酶,按其作用方式,可分为内切型菊粉酶(o-inulinase)和外切型菊粉酶(ex-inulinase)。目前,菊粉酶广泛应用于低聚果糖和高果糖浆生产、以及菊芋乙醇生产等多个领域。但到目前为止,国内外学者关于菊粉酶的研究大多注重产酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶基因克隆等方面,涉及菊粉酶分泌表达调控的报道极少。菊粉酶的表达调控机制十分复杂,而且表现为明显的菌种依赖特性。目前还没有完整的调控体系了解其合成过程,严重阻碍了菊粉酶在工业化中的应用。菊粉酶的分泌除受底物诱导、分解物阻遏外,还与发酵体系中的溶氧和氮源等因素密切相关。克鲁维酵母菊粉酶的表达受到分解产物的阻遏,该阻遏是发生在转录水平,但对于其中的调控机制仍不清楚。碳源代谢抑制因子CreA和糖代谢激活因子InuR在菊粉酶表达调控中具有重要作用。Silva-Santisteban等发现在葡萄糖、果糖和蔗糖中,菊粉酶分泌的细胞外动力学相似,但是蔗糖浓度对菊粉酶活力影响很大,而且富含O2的空气,既不能提高菊粉酶的产量也不能抑制乙醇的生产。菊粉酶的活性是采用集成生物加工策略(CBP)发酵菊芋生产乙醇的最关键因素。因此,研究和了解菊粉酶的相关调控机制,对于菊粉基原料的CBP技术的发展至关重要。我们实验室研究了K.marxianusYX01菊粉酶的表达调控的相关影响因素,结果表明菊粉对菊粉酶的产生具有一定的诱导作用,而葡萄糖对产酶过程有一定程度的抑制作用;碳源浓度对K.marxinausYX01产酶具有较为显著的抑制作用,当菊粉浓度为60g/L时,菊粉酶的活性仅有20g/L时的50%。通气量对菊粉酶分泌有较大影响,当通气量超过0.5vvm时,菊粉酶活力可达到不通气时的4倍。外加高浓度乙醇对细胞生长有明显的抑制作用,但并没有影响菊粉酶分泌,而且对于分泌到胞外的菊粉酶,其活性基本不受外加乙醇的影响。菊粉酶的产生与乙醇发酵条件是矛盾的两个方面,阐明乙醇发酵条件下菊粉酶分泌及相关代谢调控机制,是提高菊粉酶活性进而提高生产效率的关键。

多聚半乳糖醛酸酶(ploygalacturonase,PG)能够随机地水解两个非甲基化的半乳糖醛酸间的α-1,4-糖苷键,在水果和蔬菜加工领域具有重要应用。PG除在高等植物、霉菌和细菌中存在,也存在于蜗牛的消化液中。但商业化应用的半乳糖醛酸酶除含PG活性外,还存在不需要的甲酯酶(PE)和淀粉酶。K.marxianus能够分泌PG而无PE活性,是生产多聚半乳糖醛酸酶的理想菌株。目前影响K.marxianusPG合成因素的研究主要集中在碳源和溶氧两个方面。溶氧是PG合成过程中的限制因素,无氧条件有利于PG的积累,而随着溶氧浓度的增加,PG合成明显受到抑制,甚至停止分泌。同时碳源对于PG的合成也具有不同程度的影响。研究结果表明,果胶的添加有助于PG的合成分泌,而半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸或乳糖抑制了PG的合成,甚至使其无法表达。因此,合适的微氧环境(同时满足单细胞生长及PG生产的必须)及碳源诱导物的添加将是K.marxianusPG合成研究的重要方向。脂肪酶广泛应用于有机化学合成、医药、食品、皮革、生物转化等多个领域。K.marxianus分泌的脂肪酶由于具有明显的热稳定性而受到广泛关注。而且以K.marxianus作为宿主异源表达酯酶(或脂肪酶)为酯酶的研究提供了新的方向。K.marxianus能够分泌β-葡萄糖苷酶、木糖酶等纤维素水解所需的酶类,在纤维素降解过程中起重要作用。过氧化物歧化酶(SOD)[34-35]、氨肽酶等也均见于K.marxianus分泌产物中,它们也都是因其较高的热稳定性而被人们所关注。但是对于这些低产量酶来说,浓缩以及分离纯化技术的研究显得尤为重要。110综上所述,K.marxianus所产不同种类的水解酶在生产过程中具有不同的优势与缺点,但就总体而言仍停留在实验室阶段,并未真正实现工业化,主要的问题就是如何尽可能提高其产酶水平来达到工业化的要求。据文献报道,克鲁维酵母与酿酒酵母不同,属于Crabtree-negative,因此其生长发酵的调控机制存在差异。最基础的方式可以采用培养条件的优化在一定程度上提高酶活力;进一步研究产酶过程对于氧气传递的响应,全面理解氧气在产酶过程中的重要作用;最后可以采取突变育种或者基因工程改造的方式,获得较为高产的菌株。另外,对于酶的分离纯化工艺的研究,也将是推进其工业化进程的重要方面。

2K.marxianus乙醇发酵

生物乙醇是目前为止研究最早、技术最为成熟的生物质能源产品,是公认的最有可能替代化石能源的生物质能源之一。而K.marxianus因其较为广泛的碳源谱,是现今利用廉价原料生产乙醇的理想菌株。K.marxianus能够在较高温度的条件下发酵乙醇,为工业生产过程大大节约了成本,并减小了污染的可能性。表2给出了K.marxianus利用菊芋、糖蜜、乳清、纤维素等不同底物产乙醇的情况。菊芋(Jerusalemartichoke,JA)以其耐瘠薄、耐盐碱、抗干旱和生物质产量高等优点被国家列为重点发展的非粮能源植物,其块茎中的主要成分是菊粉,占干重的60%~70%,由果糖残基经β-2,1糖苷键脱水聚合而成,末端为一个葡萄糖分子,可以通过酸解和酶解等途径转化为易于发酵的果糖。以菊芋作为燃料乙醇的底物已进行了广泛的研究,其中利用同时具有产菊粉酶和乙醇发酵能力的克鲁维酵母进行乙醇发酵(CBP技术)是最有希望实现工业化生产的技术路线,但仍然存在发酵时间长、终点乙醇浓度低及剩余残糖高等缺点。最近,有学者报道了综合利用菊芋秸秆和块茎,进行全生物质的发酵过程,也为菊芋乙醇的工业化提供了更为全面的保证。我们实验室对于利用菊芋生产乙醇进行了大量的工作。筛选得到的K.marxianusYX01,以菊粉为底物,发酵终点乙醇浓度92.2g/L,达到理论值的85.5%;同时开发了批式补料工艺,菊芋干粉生料发酵的终点乙醇浓度达到94.2g/L。通过添加辅助酶制剂及换用不同的搅拌桨,进一步降低发酵过程中醪液黏度大的问题,使乙醇的终浓度及收率得到提升,为其工业化生产奠定了基础。但是,我们实验发现在相对无氧条件下乙醇得率高于有氧条件,而发酵时间却大大延长,这严重制约了菊芋乙醇的工业化进程。因此,今后的工作将从提高限氧发酵过程中菊粉酶活力或调控发酵过程的通气量来达到在较短发酵时间下实现更高的乙醇得率。K.marxianus可以直接利用乳清中的乳糖生产乙醇。乳清是干酪和干酪素生产过程中的一种副产品,主要成分为乳糖(74%),其次还有一些蛋白质、矿物质和脂肪等,是一种理想的生产乙醇的廉价原料。发酵乳清生产乙醇还可以解决乳制品生产中废水排放的问题。但是,一般来说乳清中的乳糖含量较低,使得发酵终点的乙醇浓度较低,增加了后续蒸馏成本。但是,通过培养条件的不断优化,利用乳清中的乳糖直接生产乙醇的规模化生产也将越来越具有竞争力。

对于K.marxianus发酵糖蜜生产乙醇的报道也比较广泛。糖蜜是制糖工业的一种副产品,也是一种较为理想的廉价材料。糖蜜种类较多,包括甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、葡萄糖蜜等,不同种类的糖蜜糖含量、糖种类具有差异。以甘蔗糖蜜为例,其还原糖总量可以达到50%~60%(w/v),其中蔗糖占60%左右。此外,糖蜜中还含有一些氮源、生物素等促进细胞生长的物质,但同时也含有一些对细胞有毒害作用的物质。在使用糖蜜为碳源时,由于糖浓度较高,要求细胞耐渗透压的能力好,对乙醇的耐性也要求较高。利用秸秆等纤维素原料生产乙醇一直都是人们关注的重点,廉价的原材料可以更大程度地降低燃料乙醇的生产成本,使其在燃料必威体育betwayAPP上具有更强的竞争力。秸秆中主要含有40%左右的纤维素,还含有半纤维素、木质素和灰分等组分,水解后得到的葡萄糖、木糖等可以被微生物利用生产乙醇。同步糖化发酵工艺(SSF)由于能降低分解产物对纤维素酶的抑制作用,是纤维素乙醇生产最有前途的工艺路线。从目前的研究来看,纤维素酶的最适温度为50℃左右,与大多数微生物生长的最适温度30℃或者37℃不一致,使得SSF发酵过程效率很低。K.marxianus具有在高温条件下生长并产生乙醇的特性,所以利用K.marxianus实现纤维素乙醇的同步糖解共发酵,是未来纤维素乙醇的重要研究方向。来源于Aspergillusniger的内切β-1,4葡聚糖酶(o-β-1,4-glucanase,EG)基因和来源于Thermoascusaurantiacus的β-葡糖苷酶(β-glucosidase,BGL)基因、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase,CBH)基因已成功地整合于K.marxianusNBRC1777基因组,在45~50℃条件下,实现了纤维素酶的功能表达,为今后更好地实现同步糖化发酵纤维素类原料生产乙醇奠定了基础;此外,纤维素降解后含有35%左右的五碳糖,很难被常规的乙醇发酵微生物如酿酒酵母所利用。K.marxianus可以利用木糖等生产乙醇,在五碳糖的利用方面具有较为明显的优势。但是,K.marxianus利用木糖的速率方面及乙醇的产率还需要进一步提高。以K.marxianus为宿主,利用表面展示的方法,将纤维素降解所需的各种酶类如EG、BGL、CBH及木聚糖利用的酶类如木糖苷酶、木糖转运酶等表达,构建联合加工菌株(CBP菌株),可能是未来解决纤维素乙醇生产的途径。

3K.marxianus作为宿主表达外源蛋白

酵母细胞用于外源蛋白的分泌表达一直受到人们的广泛关注,S.cerevisiae、P.pastoris等研究相对成熟的表达系统以其适于大规模生产、翻译后修饰系统较为完善以及无内毒素污染等优点而被研究人员广泛应用。但同样酵母细胞也具有信号肽加工不完全、诱导周期长等缺点。近年来,K.marxianus作为宿主细胞用于表达外源蛋白方面的应用越来越多。三种表达系统的优势和不足见表3。正是由于K.marxianus在表达外源蛋白方面所特有的优势,对其进一步的研究以及开发利用显得更为重要,而且随着研究和应用的深入,K.marxianus作为宿主表达外源蛋白将能更好地弥补另两种酵母的不足,取长补短,更加深化酵母宿主表达外源蛋白的应用。

3.1K.marxianus表达载体、启动子以及转化方法的研究进展表达载体是基因外源表达的关键。最早应用于K.marxianus转化的表达载体,pGL2,出现在1984年。但是,真正使得K.marxianus作为表达宿主而受到人们关注是由于pKD1质粒的发现,pKD1质粒全长4.8kb,目前以其为基础而获得的多种杂交质粒已广泛应用于外源蛋白表达的研究中。启动子的选择决定了外源基因表达的成败。目前应用于K.marxianus表达系统的启动子分为三类:(1)其自身启动子,如PCLP,INU1[68-69]等,而且有实验表明,比起S.cerevisiae启动子,K.marxianus自身启动子会明显提高异源基因在其中的表达量。Bergkamp等使用INU1成功地实现了β-半乳糖苷酶的异源表达;(2)来源于S.cerevisiae启动子,如TDH3,GAL1等。目前针对它们的研究也较为广泛,许多S.cerevisiae中较为成熟、功能明确的启动子均可直接用于K.marxianus外源基因表达。Nonklang等以ScTDH3为启动子使得曲霉α-淀粉酶基因得到表达;Lee等测试了四种在S.cerevisiae较为常见的启动子应用于K.marxianus异源表达的情况,4种启动子表达强弱为PGPD>PADH~PTEF>>PCYC,为今后异源基因在K.marxianus不同程度的表达奠定了基础;(3)非酵母启动子,如利用Tet-off[70]启动子构建的pTetGus载体成功地实现了β-葡萄糖醛酸酶基因的异源表达。适当的转化方法也在整个重组过程中发挥重要作用。一套由LiAc介导的K.marxianus细胞转化方法可以简单、快捷地用于K.marxianus的转化过程。而且DMSO对于转化过程具有抑制作用,而DTT具有促进作用,10mmol/L的DTT最适于转化过程的进行。多基因同时整合入K.marxianus染色体技术[73]的实现不但大大节省了人力与时间,也说明了K.marxianus作为宿主正在研究中逐步趋于成熟。

3.2典型外源蛋白在K.marxianus表达系统中的分泌表达K.marxianus作为宿主表达异源蛋白具有更高的分泌效率,这为后续的分离纯化以及工业化生产降低成本奠定了基础。研究表明,K.marxianus所表达的一种热稳定酯酶,50%左右分泌到了胞外,而相应的在K.lactis和S.cerevisiae中只有12%左右,而且在K.marxianus中,只有17%的酶存在于周质空间,但在K.lactis中达到了25%,在S.cerevisiae中,甚至超过了80%。负责酵母菌絮凝性状的絮凝基因成功地在K.marxianus中得到表达[71],使其具有絮凝性状,可能会提高其对纤维素预处理过程中生成的有毒物质的耐性及乙醇耐性,为今后其在纤维素乙醇发酵中的应用提供了保证。对于K.marxianus外源基因的表达研究在很大程度上受制于其基因工程操作方面理论的不足,很多在S.cerevisiae和K.lactis中比较成熟的转化系统、启动子等都很难用于K.marxianus的表达过程,而且成功表达的基因在其蛋白产量、酶活力或者优良性状的获得方面还有待于进一步改善,蛋白或者酶的进一步分离提纯方法以及产量的进一步提高也有待于更多的研究。

4展望

综上所述,K.marxianus在产酶、乙醇发酵、外源蛋白分泌等方面都具有较为广泛的应用。K.marxianus所分泌的水解酶用途广泛,在食品、医药、生物材料、发酵等诸多领域均有较大的必威体育betwayAPP需求。而其利用菊芋、乳清、糖蜜、纤维素等生产乙醇也十分符合目前生物能源的发展趋势,为降低成本、增加生物乙醇工业化可行性打下基础。K.marxianus在外源蛋白表达以及基因工程改造上的进展拓宽了其在工业生物技术方面的应用前景,这使K.marxianus在整个生物技术领域实现了全面的、完整的应用体系。但要实现K.marxianus在工业生物技术领域的广泛应用,尚需要更多的理论支持。首先,在产酶方面,K.marxianus分泌的酶类普遍表现出受分解产物的抑制作用,所以各酶类的分泌表达机理有待于进一步研究,阐明机理、消除抑制作用最终实现可控表达;其次,在乙醇发酵方面,由于其乙醇耐受性较酿酒酵母差,所以,提高K.marxianus的乙醇耐受性将是该菌株能在生物乙醇产业中应用的前提;再次,在外源蛋白表达和基因工程改造方面,目前对于K.marxianus外源基因的表达研究在很大程度上受制于其基因工程操作方面理论的不足,需要构建更加完善的表达系统和启动子。虽然K.marxianus全基因组序列粗框架已公布,但其基因组的注释及代谢网络的确定将为其在基因工程方面的应用提供更加有效的理论支持。

作者:高教琪韩锡铜孔亮袁文杰王娜白凤武单位:大连理工大学生命科学与技术学院

中国生物工程杂志责任编辑:田老师    阅读:人次

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