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硫酸黏菌素稳定性探讨

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《中国抗生素杂志》2016年第二期

摘要:

本文研究了硫酸黏菌素溶液在不同pH、温度、搅拌速度下的稳定性。结果表明硫酸黏菌素对pH的变化较为敏感,在pH6时较为稳定,在强碱环境下,pH越高,处理时间越长硫酸黏菌素的稳定性越差。升高温度和搅拌速度的变化不会破坏其结构。

关键词:

硫酸黏菌素;稳定性;效价

硫酸黏菌素,别名抗敌素、克里斯汀。对大多数的革兰阴性杆菌有较强的抗菌作用,对铜绿假单胞菌的作用最为显著,对大肠埃希菌、沙门菌、痢疾杆菌、流感杆菌、百日咳杆菌等也有良好的作用。从结构上来说,硫酸黏菌素是一种碱性多肽类抗生素,拥有七肽环和三肽尾[1-2],结构如图1所示。当前制药行业主要采用离子交换法分离提取硫酸黏菌素,生产过程耗水量大,同时产生大量的废水,工艺时间长。在当前国内环保压力日趋加大的情况下,工艺革新迫在眉睫。对其稳定性的深入认识是工艺革新的重要基础数据。然而文献中围绕硫酸黏菌素的研究大多集中在药物制剂[3]、分析方法[4]、养殖业应用[3-6]、菌种选育与发酵工艺研究等方面[7-9],进行稳定性研究报道极少,只有陈勇等[10]研究了硫酸黏菌素在30℃未酸化发酵液、酸化滤液、离子交换解析液及浓缩液中硫酸黏菌素的稳定性,但是如果要想对硫酸黏菌素的提取工艺进行革命性的变革,仍需对硫酸黏菌素在各种条件下的稳定性进行广泛而深入的研究。而这恰是本论文研究的出发点。

1材料与方法

1.1材料与仪器硫酸黏菌素符合欧洲药典标准,产品由河北圣雪大成制药有限责任公司提供,硫酸黏菌素标准品由北京中科仪友化工技术研究院提供。氢氧化钠、硫酸、磷酸均为分析纯,天津市大茂化学试剂厂;无水硫酸钠为分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;水为实验室自制去离子水。AR1140型分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司;高效液相色谱仪,南京普惠生物技术有限公司。

1.2试验方法

1.2.1硫酸黏菌素溶液的配制取15g硫酸黏菌素,加入一定量去离子水后搅拌使其溶解,同时控制搅拌的转速,以防产生大量的泡沫。用去离子水定容至1.5L制成1%的溶液,用pH计测得初始溶液的pH为6.72。

1.2.2硫酸黏菌素效价的测定采用高效液相色谱仪进行纯度分析。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)。色谱条件如下,流速为1.0mL/min,柱温30℃,检测波长为215nm,进样体积20μL。将4.46g无水硫酸钠溶解到900mL水中,加入2.5mL磷酸,然后用水稀释到1000mL,即试液A。按照体积比试液A:乙腈=78:22制成流动相[11-13]。精密称取硫酸黏菌素对照品25mg,用0.05mol/L硫酸稀释到50mL,制成标准液。精密称取硫酸黏菌素检品试样,用0.05mol/L硫酸稀释成约10000U/mL的溶液,摇匀既得检测液。将上述两溶液分别用孔径0.22μm的水系微孔滤膜滤过,贮存于小容器中。待系统平衡后,注入标准液,当连续3针黏菌素E1和E2峰面积和的变异系数(RSD)在2%以内,注入检测液,实验中每一测试样均进3针,取其平均值。实验中最大变异系数(RSD)为0.62%,说明影响因素相对较少,数据可靠。

1.2.3硫酸黏菌素溶液在不同溶液pH的条件调节恒温加热磁力搅拌器转速300r/min,温度为30℃。取100mL配好的浓度为1%的硫酸黏菌素溶液,用1mol/L的硫酸和1mol/L的氢氧化钠调节pH为2~9,搅拌30min后,采用HPLC法测定效价。在相应的条件下重复试验3次,当变异系数(RSD)在2%以内时取其平均值为最终的实验数据。

1.2.4硫酸黏菌素溶液在不同溶液温度的条件取100mL配好的上述溶液,调节恒温加热磁力搅拌器转速300r/min。调节温度为30~80℃,分别搅拌30min后采用HPLC法测不同温度下硫酸黏菌素的效价。在相应的条件下重复试验3次,当变异系数(RSD)在2%以内时取其平均值为最终的实验数据。
1.2.5硫酸黏菌素溶液在碱性条件下随时间变化的条件分别取300mL配好的上述溶液于两个烧杯中,用1mol/L的氢氧化钠调pH为12和11。控制溶液温度为30℃,每半小时取一次样,用HPLC法检测硫酸黏菌素在碱性条件下随时间变化的效价。在相应的条件下重复试验3次,当变异系数(RSD)在2%以内时取其平均值为最终的实验数据。

1.2.6硫酸黏菌素溶液在不同搅拌速度下量取上述配好的溶液100mL,调节恒温磁力搅拌器的温度为30℃,调节转速为100r/min,搅拌30min,测该搅拌速度下的效价。调节转速为200、300、400、500和600r/min,搅拌30min,测该搅拌速度下的效价。在相应的条件下重复试验3次,当变异系数(RSD)在2%以内时取其平均值为最终的实验数据。

2结果与分析

2.1pH的变化对硫酸黏菌素稳定性的影响pH的变化对硫酸黏菌素的稳定性试验结果见图2。由图2可知,硫酸黏菌素在pH为6附近效价最高,随着pH的降低,效价逐渐降低,从pH6到pH2效价降低了4%,效价降低的较为平缓。随着溶液pH的升高,从pH6到pH8效价降低了2.04%,而随着pH进一步升高,效价急剧降低。总体上在pH2到pH8范围内效价变化相对平缓,说明在水溶液中硫酸黏菌素发生电离平衡,即硫酸黏菌素的离子浓度和pH之间存在平衡关系。pH的变化直接影响了溶液和固形物之间的吸附平衡。当pH大于8时效价急剧降低,主要原因是碱性增强,硫酸黏菌素会转变成相应的碱,而黏菌素碱在水溶液中溶解度较低而沉淀析出,此外在强碱性条件下硫酸黏菌素的稳定性较差,对硫酸黏菌素的高级结构和空间结构破坏性较强。这些因素都会对硫酸黏菌素在水溶液中的稳定性产生影响。

2.2温度的变化对硫酸黏菌素稳定性的影响温度的变化对硫酸黏菌素的稳定性试验结果见图3。从图中可以发现:随着温度的升高效价稳步升高,由30℃时的246000U/mL升高到80℃的271000U/mL。效价升高了9.22%,主要原因是硫酸黏菌素在水溶液中存在电离平衡,温度的变化会对电离平衡产生影响,温度升高其电离程度加大。推断可能是其极性疏水性发生改变引起了空间结构变化。利用硫酸黏菌素在高温条件下的性质,可以采用热絮凝的方式进行发酵液的前处理,从而去除一部分的杂质蛋白,有利于提高过滤速度和产品质量。

2.3硫酸黏菌素在碱性条件下随时间变化的稳定性时间的变化对硫酸黏菌素的稳定性试验结果见图4。由于沉淀法提取硫酸黏菌素常需要在较高的pH下使硫酸黏菌素沉淀,因此在强碱条件下硫酸黏菌素的稳定性将直接影响产品的收率和质量。本实验选取了pH11和pH12两个强碱性环境,从图中可以看出随着时间的推移,无论pH11或pH12硫酸黏菌素的效价逐渐降低,说明对同一pH下,时间越长硫酸黏菌素稳定性越差,破坏的越严重。在1.5h以内两条曲线的下降趋势基本相同,但1.5h以后,在pH为12的溶液效价开始迅速下降而pH11的溶液下降较为平缓。5h内pH11的溶液效价损失11%,pH12的溶液效价损失16.97%,说明碱性越强对黏杆的破坏越严重。在不影响沉淀效果的前提下,应选择相对较低的pH。

2.4搅拌速度对黏菌素稳定性的影响搅拌速度对硫酸黏菌素的稳定性试验结果见图5。从图中可以看出随着搅拌速度的增加,效价的变化并不剧烈,最低在236000U/mL,最高在238000U/mL。基本维持在一个稳定的区间里。因此搅拌速度对硫酸黏杆菌素的稳定性影响不大,并不会破坏硫酸黏菌素的结构。

3结果与讨论

pH会对硫酸黏菌素的稳定性产生影响。过酸和过碱都会破坏硫酸黏菌素的稳定性。碱性条件下硫酸黏菌素的高级结构和空间结构破坏程度更大。在pH6时稳定性较好。在一定温度范围内温度升高,有利于提高效价。对同一pH下,时间越长硫酸黏菌素的结构破坏的越严重,稳定性越差。碱性越强对硫酸黏菌素的破坏越严重,稳定性越差。搅拌速度并不会破坏硫酸黏菌素的结构,不会对硫酸黏菌素的稳定性产生明显的影响。

参考文献

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[13]陈伟东,邓宗亮.硫酸黏菌素最大杂质分析[J].广东药学,2005,5:6-7.硫酸黏菌素稳定性的研究杨立国等

作者:杨立国 赵金芳 刘俊果 单位:河北科技大学生物科学与工程学院

中国抗生素杂志责任编辑:杨雪    阅读:人次

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